二氧化碳培養(yǎng)箱中的主要污染源:細(xì)菌、真菌(霉菌和酵母菌)、病毒、支原體、非同種細(xì)胞。
對于細(xì)胞來說,理想的培養(yǎng)環(huán)境同樣也適合這些污染物的生存,培養(yǎng)箱本身是不會辨別的,而細(xì)胞培養(yǎng)中大部分時(shí)間里細(xì)胞都是位于培養(yǎng)箱內(nèi),因此箱體內(nèi)能否抑菌或滅菌關(guān)鍵!
細(xì)菌:細(xì)菌污染后,培養(yǎng)基1-2天就會變色,對細(xì)胞生長影響明顯,應(yīng)迅速將污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離,滅菌后丟棄,還要用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺。
病毒:由于病毒寄生生存,爆發(fā)后盡快和正常細(xì)胞隔離,丟棄處理,相對來說容易處理,對操作者威脅較大;盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng),但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此,潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。
真菌(霉菌和酵母菌):真菌生長的比較慢,不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn),但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了;目前沒有好的抑制方法,包括現(xiàn)在常用的兩性霉素,一旦污染容易反復(fù)爆發(fā),尤其孢子很難殺滅。
支原體:支原體污染后,因?yàn)樗鼈儾粫辜?xì)胞死亡可以與細(xì)胞長期共存,培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁,細(xì)胞無明顯變化,外觀上給人以正常感覺,實(shí)則細(xì)胞已經(jīng)受到多方面潛在影響,如引起細(xì)胞變形,影響DNA合成,抑制細(xì)胞生長等,往往被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)者忽視。
非同種細(xì)胞:即細(xì)胞交叉污染,由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開,往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。目前,世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染,致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效。
因此,以上污染一旦發(fā)生,細(xì)胞*后基本只能丟棄,實(shí)驗(yàn)無法挽救,對于許多取樣困難的實(shí)驗(yàn)損失無法估量!
目前,二氧化碳培養(yǎng)箱的滅菌技術(shù)主要有干熱、濕熱、紫外燈照射、消毒劑擦拭等。
高溫干熱空氣滅菌是目前的*有效的滅菌技術(shù),能消滅所有微生物污染源(包括耐高溫的芽孢桿菌);濕熱滅菌通常用于高壓蒸汽滅菌中,比較少用在CO2培養(yǎng)箱上,濕熱滅菌在常壓下又叫煮沸法,煮沸的水溫一般至少需為100℃,細(xì)菌繁殖體煮沸5分鐘被殺死,但芽胞常需煮沸2小時(shí)以上才可被殺死;紫外燈照射法的有效性受很多因素影響,如遮擋、時(shí)間、強(qiáng)度、照射距離,濕度等,滅菌效果很難保證;消毒劑擦拭法是對表面滅菌的方法,適合于平整的表面如實(shí)驗(yàn)臺面,而箱體內(nèi)部設(shè)計(jì)的死角、各種器件因無法擦拭等因素導(dǎo)致滅菌效果也很有限,而且含氯、碘的消毒劑對于不銹鋼有腐蝕作用,不能對不銹鋼箱體進(jìn)行擦拭滅菌。